Mediante criomicroscopía electrónica, los investigadores ahora pueden congelar biomoléculas en movimiento y retratarlos con una resolución atómica. Esta tecnología ha llevado la bioquímica a una nueva era.

Durante los últimos años, numerosas estructuras asombrosas de la maquinaria molecular de la vida han llenado la literatura científica: la aguja de inyección de Salmonella para las células atacantes; proteínas que confieren resistencia a la quimioterapia y antibióticos; complejos moleculares que controlan el ritmo; la reacción de captura de luz durante la fotosíntesis y un sensor del tipo que nos permite escuchar. Estos son sólo algunos ejemplos de los cientos de biomoléculas se han capturado ahora con microscopía criomicroscopía electrónica (crio-EM).
En los últimos años, investigadores han publicado estructuras atómicas de numerosas proteínas. A. Un complejo de proteínas que rigen el ritmo circadiano. B. Un sensor del tipo que lee cambios de presión en el oído y nos permite escuchar. C. El virus Zika. Créditos: Nobel Foundation.

Cuando los investigadores empezaron a sospechar que el virus Zika estaba causando la epidemia de daño cerebral en recién nacidos en Brasil, emplearon crio-EM para visualizar el virus. Durante algunos meses se generaron imágenes tridimensionales del virus con resolución atómica y los investigadores pudieron comenzar la búsqueda de objetivos potenciales para los productos farmacéuticos.

Jacques Dubochet, Joachim Frank y Richard Henderson han realizado descubrimientos innovadores que han permitido el desarrollo de crio-EM. El método ha llevado a la bioquímica a una nueva era, lo que hace más fácil que nunca capturar imágenes de biomoléculas.

Fotografía - una clave importante para el conocimiento

En la primera mitad del siglo XX, las biomoléculas -proteínas, ADN y ARN- fueron tierra incognita en el mapa de la bioquímica. Los científicos sabían que desempeñaban papeles fundamentales en la célula, pero no tenían ni idea de su apariencia. Fue sólo en la década de 1950, cuando los investigadores en Cambridge comenzaron a exponer los cristales de proteínas a rayos X, que era posible primero visualizar sus ondas onduladas y estructuras en espiral.

A principios de los años ochenta, el uso de la cristalografía de rayos X se complementó con el uso de espectroscopia de resonancia magnética (RMN) para el estudio de proteínas en estado sólido y en solución. Esta técnica no sólo revela su estructura, sino también cómo se mueven e interactúan con otras moléculas. Gracias a estos dos métodos, ahora hay bases de datos que contienen miles de modelos de biomoléculas que se utilizan en todo, desde la investigación básica hasta el desarrollo farmacéutico.

Sin embargo, ambos métodos sufren de limitaciones fundamentales. La RMN en solución sólo funciona para proteínas relativamente pequeñas. La cristalografía de rayos X requiere que las moléculas formen cristales bien organizados, tales como cuando el agua se congela en hielo. Las imágenes son como retratos en blanco y negro como si provinieran de las primeras cámaras, además su rigidez planteaba muy poco sobre la dinámica de la proteína.

Además, muchas moléculas no se forman en cristales, lo que hizo que Richard Henderson abandonara la cristalografía de rayos X en la década de los 70's y aquí es donde comienza la historia del Premio Nobel de Química 2017.

Problemas con cristales hicieron que Henderson cambiará el camino

Richard Henderson recibió su doctorado del bastión de cristalografía de rayos X en Cambridge, Reino Unido. Él utilizó un método para la obtención de imágenes de las proteínas, pero se produjeron reveses cuando intentó cristalizar una proteína que estaba naturalmente incrustada en la membrana que rodea a la célula.

Las proteínas de la membrana son difíciles de manejar. Cuando son removidas de su entorno natural - la membrana - a menudo se agrupan en una masa inútil. La primera proteína de membrana que Richard Henderson trabajó era difícil de producir en cantidades adecuadas; la segundo fracaso al cristalizar.

Después de años de decepción, se volvió hacia la única alternativa disponible: el microscopio electrónico. En ese tiempo estaba a discusión si la microscopía electrónica era realmente una opción. Transmisión microscópica electrónica, como se llama la técnica, funciona más o menos como la microscopía ordinaria, pero un haz de electrones se envía a través de la muestra en lugar de luz. La longitud de onda de los electrones es mucho más corta que la luz, por lo que el microscopio electrónico puede hacer visibles estructuras muy pequeñas -incluso la ubicación de átomos individuales-.

En teoría, la resolución del microscopio electrónico fue más que suficiente para que Henderson obtuviera la estructura atómica de la proteína de una membrana, pero en la práctica el proyecto era casi imposible. Cuando el microscopio electrónico fue inventado en la década de 1930, los científicos pensaron que sólo era adecuado para estudiar materia muerta puesto que el intenso haz de electrones necesario para obtener imágenes de alta resolución incinera muestras biológicas y, si el haz se debilita, la imagen pierde su contraste y se vuelve borrosa.

Además, la microscopía electrónica estaba ante un problema, una condición en la cual las biomoléculas se deterioran porque el agua circundante se evapora. Cuando las biomoléculas se secan, se dañan y afectan la estructura natural, haciendo a las imágenes inútiles. Casi todo indicaba que Richard Henderson fracasaría, pero el proyecto fue salvado por la proteína especial que había elegido para estudiar: bacteriorhodopsin.

Lo mejor hasta ese momento no era lo suficientemente bueno para Henderson

Bacteriorhodopsin es una proteína de color púrpura que está incrustado en la membrana de un organismo que realiza fotosíntesis, donde captura la energía de los rayos del sol. En lugar de eliminar la proteína sensible de la membrana, como Richard Henderson había tratado anteriormente de hacer, él y su colega completaron la membrana púrpura y la pusieron bajo el microscopio electrónico. Cuando la proteína permaneció rodeada por la membrana conservó su estructura; fue así como cubrieron la superficie de la muestra con una solución que la protegía de secarse en el vacío.

El duro haz de electrones fue un problema importante, pero los investigadores emplearon la membrana para proteger las moléculas de bacteriorrodopsina. En lugar de proyectar con una dosis completa de electrones, usaron un flujo de haz más débil con de la muestra. El contraste de la imagen
eran pobres y no se podían ver las moléculas individuales, pero aprovecharon el hecho de que las proteínas se empaquetaban y se orientaban en la misma dirección. Cuando todas las proteínas ejercen difracción a los haces de electrones de manera casi idéntica, pudieron obtener una imagen detallada basada en el patrón de difracción, usando un modelo matemático similar al utilizado en la cristalografía de rayos X.

En la siguiente etapa, los investigadores removieron la membrana bajo la microscopio electrónico, tomando imágenes de muchos ángulos diferentes. De esta manera, en 1975 fue posible producir un modelo 3D de la estructura de bacteriorhodopsina, que mostró cómo la cadena de proteínas se
movian a través de la membrana.

Era la mejor imagen de una proteína generada usando un microscopio electrónico. Muchas personas
estaban impresionados por la resolución, que era de 7 Ångström (0.0000007 milímetros), pero no era suficiente para Richard Henderson. Su objetivo era lograr la misma resolución que la proporcionada por Cristalografía de rayos X, alrededor de 3 Ångström, y estaba convencido de que la microscopía
podía hacerlo.

Henderson produce la primera imagen a resolución atómica

Durante los siguientes años, la microscopía electrónica mejoró. Los lentes mejoraron y la criotecnología se desarrolló, en el que las muestras se enfriaron con nitrógeno líquido durante las mediciones, protegiéndolas de ser dañado por el haz de electrones.

Richard Henderson poco a poco agregó más detalles al modelo de la bacteriorrodopsina. Para obtener imágenes más nítidas empleo los mejores microscopios electrónicos del mundo. Todos tenían sus debilidades, pero se complementaban entre sí. Finalmente, en 1990, 15 años después de haber publicado el primer modelo, Henderson logró su meta y fue capaz de presentar una estructura de bacteriorrodopsina con la resolución atómica.

Demostró que el crio-EM podría proporcionar imágenes tan detalladas como las generadas mediante cristalografía de rayos X que era un hito crucial. Sin embargo, este progreso se basó en una excepción: la proteína se envasaba naturalmente en la membrana. Pocas otras proteínas espontáneamente se ordenaban de esta manera. La cuestión era si el método podía generalizarse: utilizar un microscopio electrónico para generar imágenes 3D de alta resolución de proteínas que estaban dispersados ​​aleatoriamente en la muestra y orientados en diferentes direcciones. Richard Henderson creía que sería posible, mientras que otros pensaban que esto era una utopía.

En el otro lado del Atlántico, en el Departamento de Salud del Estado de New York, Joachim Frank
trabajó mucho para encontrar una solución a ese problema. En 1975, presentó una estrategia teórica donde la información aparentemente mínima encontrada en las imágenes bidimensionales del microscopio electrónico podrían fusionarse para generar un modelo tridimensional de alta resolución. Le llevó más de un década para realizar esta idea.

Frank refina análisis de imágenes

La estrategia de Joachim Frank fue emplear una computadora para discriminar entre trazas de proteínas posicionadas aleatoriamente y el fondo en una imagen difusa obtenida por un microscopio electrónico. Desarrolló un método matemático en el cual la computadora identificaba diferentes patrones en la imagen. La computadora entonces ordenaba patrones similares en el mismo grupo y fusionando la información de estas imágenes generaba una imagen más nítida. De esta manera obtenía un modelo de alta resolución y bidimensional donde las imágenes mostraban la misma proteína pero desde diferentes ángulos. Los algoritmos para el software fueron completados en 1981.

El siguiente paso fue determinar matemáticamente cómo diferentes imágenes bidimensionales se relacionaban entre sí y, sobre esta base, crear una imagen en 3D. Frank publicó su método de análisis de imágenes para generar el modelo de la superficie de un ribosoma, a mediados de los 80´s, la gigantesca maquinaria molecular que genera proteínas dentro de la célula.

El método de procesamiento de imágenes de Joachim Frank fue fundamental para el desarrollo de crio-EM. En 1978, al mismo tiempo que Frank estaba perfeccionando su algoritmo, Jacques Dubochet fue reclutado por el Laboratorio Europeo de Biología Molecular en Heidelberg para resolver otro problema del microscopio: cómo evitar que se secarán muestras biológicas y se dañarán cuando se exponen al vacío.

Dubochet obtiene vidrio del agua

En 1975, Henderson usó una solución de glucosa para proteger su membrana de la deshidratación, pero este método no funcionó para biomoléculas solubles en agua. Otros investigadores habían tratado de congelar las muestras porque el hielo se evapora más lentamente que el agua, pero los cristales de hielo interrumpieron los haces haciendo que las imágenes fueran inservibles.

El agua producto de la vaporización era un dilema importante. Ahí Jacques Dubochet vio una solución potencial: enfriar el agua tan rápidamente que solidificará en su forma líquida para formar un vidrio en lugar de cristales. Aunque vidrio parece ser un material sólido, es un fluido porque tiene moléculas desordenadas. Dubochet se dio cuenta de que si podía obtener agua enforma de vidrio -también conocido como agua vitrificada- el haz de electrones se difractaría uniformemente y
produciría fondo uniforme.

Inicialmente, el grupo de investigación intentó vitrificar pequeñas gotas de agua en nitrógeno líquido a -196 ° C, pero tuvieron éxito sólo cuando reemplazaron el nitrógeno con etano que, a su vez,
se enfriaba con nitrógeno líquido. Bajo el microscopio vieron una gota que era como nada de lo que habían visto antes. Primero asumieron que era etano, pero cuando la gota se calentó ligeramente las moléculas se reorganizaron y formaron una estructura de un cristal de hielo. Fue un triunfo en particular, puesto que algunos investigadores no podían vitrificar gotas de agua. Ahora
sabemos que el agua vitrificada es la más común forma de agua en el universo.

Una técnica simple para el contraste

Tras el gran avance en 1982 de Dubochet, grupos de investigadores desarrollaron rápidamente las bases técnicas que todavía se utiliza en crio-EM.  Disolvieron muestras biológicas -inicialmente
diferentes formas de virus- en el agua. La solución se extendió a través de una fina malla de metal como una fina película. Utilizando una construcción en forma de arco, el etano líquido formó una delgada película de agua vitrificada.

En 1984, Jacques Dubochet publicó las primeras imágenes de diferentes virus, redondos y hexagonales, que se mostraban en marcado contraste con el fondo de agua vitrificada. El material biológico podía ser relativamente fácil de preparar para la microscopía electrónica y los investigadores pronto aprendieron la nueva técnica de Dubochet.
De la blobología a la revolución
Las piezas más importantes de crio-EM estaban en su lugar, pero las imágenes todavía tenían una resolución pobre. En 1991, cuando Joachim Frank preparó ribosomas usando el método de vitrificación de Dubochet y analizó las imágenes con su propio software, obtuvo una estructura 3D que tenía una resolución de 40 Å. Era un sorprendente paso adelante para la microscopía electrónica, pero la imagen sólo mostraba la superficie del ribosomas. Francamente, parecía una gota y la imagen ni siquiera se acercaba a la resolución atómica de la cristalografía de rayos X.

Debido a que el crio-EM raramente podía visualizar nada más que una superficie desigual, el método fue a veces llamado "blobología". Sin embargo, cada tuerca y tornillo del microscopio electrónico fue optimizado, en gran medida debido a Richard Henderson mantuvo obstinadamente su visión de que la microscopía electrónica proporcionaría imágenes nítidas de átomos individuales. La resolución de
Ångström por Ångström fue superado en 2013, cuando un nuevo tipo de detector de electrones entró en uso.

Cada rincón escondido de una célula podía ahora ser explorado

Ahora el sueño es realidad, y estamos ante un desarrollo explosivo dentro de la bioquímica. La cryo-EM se reconoció tan revolucionario: el método de vitrificación de Dubochet es relativamente fácil de usar y requiere un tamaño de muestra mínimo. Debido al rápido proceso de enfriamiento, las biomoléculas se pueden congelar en cualquier momento y los investigadores pueden tomar imágenes que capturan diferentes partes de un proceso. De esta manera, se producen "películas" que revelan cómo las proteínas se mueven e interactúan con otras moléculas.
La resolución del microscopio electrónico ha mejorado radicalmente en los últimos años, desde una manchas hasta poder visualizar las proteínas a una resolución atómica. Créditos: Martin Högbom.

Utilizando crio-EM, es más fácil que nunca describir las proteínas en una membrana, que a menudo funciona como objetivos para productos farmacéuticos y grandes complejos moleculares. Sin embargo, las proteínas pequeñas no pueden ser estudiadas con microscopía electrónica, pero se pueden visualizar mediante espectroscopia de RMN o cristalografía de rayos X.

Después de que Joachim Frank presentó su método general de procesamiento de imágenes en 1975, un investigador escribió: "Si tales métodos pueden ser perfeccionados, entonces, el cielo sería el límite ".

Ahora estamos allí - el cielo es el límite. Jacques Dubochet, Joachim Frank y Richard Henderson han aportado, a través de sus investigaciones, "el mayor beneficio para la humanidad". Cada esquina de una célula puede ser capturados en detalle y la bioquímica tiene un futuro emocionante.

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